微生物法

1.原理
葉酸是酪乳酸桿菌（Lactobacillus casei, L. C, ATCC 7469）生長所必需的營養(yǎng)素。在一定條件下，L.C的生長繁殖與培養(yǎng)基中葉酸含量呈正比關(guān)系，細(xì)菌增殖的量以光密度值計，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，計算出樣品中葉酸的含量。
2.適用范圍
參考《Methods of Vitamin Assay》，第4版。本方法適用于各類食物中葉酸的測定。檢測限為0.1ng。
3.儀器與設(shè)備
（1） 恒溫培養(yǎng)箱
（2） 離心機
（3） 高壓消毒鍋
（4） 震蕩器
（5） 接種針和接種環(huán)
（6） 分光光度計
4.試劑
除特殊說明外，本實驗中所有試劑均為分析純，水為蒸餾水。
（1） 菌種：酪乳酸桿菌（Lactobacillus casei, L.C, ATCC 7469）
（2） 磷酸緩沖液（0.05mol/L, pH6.8）:稱取4.35g Na3PO4·12H2O,10.39g Na2HPO4·7H2O溶解于800ml水中。臨用前用約5g抗壞血酸調(diào)節(jié)pH至6.8。（注：葉酸對光、熱敏感，易被氧化破壞，抗壞血酸有助于保護葉酸被氧化。）
（3） 雞胰酶溶液： 稱取100mg干燥的雞胰酶（Difco公司）（注：含有葉酸軛合酶，用于水解葉酸多谷氨酸鹽）， 加入20ml磷酸緩沖液制成勻漿，3000rpm離心10min,取上清液備用。臨用前現(xiàn)配。
（4） 蛋白酶-淀粉酶溶液：分別稱取200mg蛋白酶（Sigma公司）和淀粉酶（Sigma公司），加入20ml磷酸緩沖液制成勻漿，離心3000rpm 10min,取上清液備用。臨用前配制。
（5） 2+8乙醇溶液：量取20ml無水乙醇溶液，加入80ml水混勻。
（6） 01mol/L NaOH: 稱取0.4g氫氧化鈉，加2+8乙醇溶液溶解并稀釋至1L。
（7） 10mol/L NaOH。稱取400g氫氧化鈉，加水溶解并稀釋至1L。
（8） 葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液（200mg/ml）：準(zhǔn)確稱取200mg葉酸標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司，純度大于98%），用0.01mol/L NaOH溶解并定容至1L。儲存于棕色瓶中。
（9） 葉酸標(biāo)準(zhǔn)中間液（200ng/ml）：準(zhǔn)確吸取1.0ml葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用0.01mol/L NaOH 溶解并定容至1L。儲存于棕色瓶中。待標(biāo)定。
標(biāo)定：準(zhǔn)確吸取1ml葉酸標(biāo)準(zhǔn)中間液，用0.1mol/L NaOH定容至10ml。以0.1mol/L NaOH調(diào)零點，比色杯厚度1cm，波長256nm，測定3次紫外吸光度值，取平均值，按下式計算標(biāo)準(zhǔn)中間液濃度。

式中：
X1 -- 葉酸標(biāo)準(zhǔn)中間液濃度，ng/ml；
A -- 標(biāo)準(zhǔn)中間液平均紫外吸光度值；
E -- 摩爾消光系數(shù)24,500；
M -- 葉酸分子量441.42；
10-- 測定紫外吸光度值時的稀釋倍數(shù)；
106 -- 由g/L換算成ng/ml的換算系數(shù)。
（10） 葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.2ng/ml）:準(zhǔn)確吸取1.0ml葉酸標(biāo)準(zhǔn)中間液，用磷酸緩沖液稀釋定容至1L。
（11） 2.4mol/L HCl：量取20ml濃鹽酸，加水稀釋至100ml。
（12） 酶解酪蛋白溶液：將8g碳酸氫鈉溶解于1L水中，加入60g去維生素酪蛋白（Sigma 公司），用10mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至 8.0（調(diào)pH時應(yīng)小心，不要過堿后再加酸反復(fù)調(diào)節(jié)，避免酪蛋白結(jié)塊）。加入300mg胰酶，攪拌20min，使胰酶混勻充分。再加入2.5ml甲苯，置37℃恒溫箱酶解48～72h（此步驟是將酪蛋白酶解為L.C可以利用的小分子肽。酶解時間不易超過72h，如時間過長，配成的培養(yǎng)基不利于細(xì)菌生長）。將酪蛋白液從恒溫箱中取出，121℃高壓30min以終止反應(yīng)并去除甲苯。冷卻，加10g硅藻土攪拌，用墊有濾紙的布氏漏斗過濾。向濾液中加入約60ml冰乙酸調(diào)節(jié)pH至3.7。稱取活性炭12g，加入濾液中攪拌10min，用布氏漏斗過濾，重復(fù)三次。每次過濾時，布氏漏斗內(nèi)加有10g硅藻土協(xié)助過濾。后濾液用水稀釋至1200ml，4℃冰箱保存1年（活性碳可吸附酪蛋白中的葉酸以減少試劑空白，同時也可吸附肽及氨基酸，應(yīng)注意控制攪拌時間）。取10ml酶解后的酪蛋白溶液加入已稱重的蒸發(fā)皿中，沸水浴蒸發(fā)至干。將蒸發(fā)皿置于100℃恒溫烤箱內(nèi)干燥至恒重，在干燥器中冷卻至室溫。稱量蒸發(fā)皿的重量，蒸發(fā)皿內(nèi)固體重量，如固體重量小于400mg，即每毫升酪蛋白溶液中固體含量<40mg，則棄除酪蛋白液，重新制備。
（13） 黃嘌呤溶液：取0.4g黃嘌呤，加入10ml氨水，加熱溶解，用水稀釋至100ml。冰箱保存。
（14） 腺嘌呤-鳥嘌呤-尿嘧啶：分別稱取硫酸腺嘌呤，鹽酸鳥嘌呤和尿嘧啶各0.2g，加入2.4 mol/L HCl溶液10 ml，加熱溶解，用水稀釋至100ml，室溫貯存。
（15） 乙酸緩沖液（1.7mol/L,pH4.5）：38.65g無水乙酸鈉，19.8ml冰乙酸，加水稀釋至500ml。
（16） 維生素溶液：取10mg核黃素溶解于40 ml乙酸緩沖液中。取0.2mg生物素，2.5mg NaHCO3，20mg對氨基苯甲酸，40mg鹽酸吡多醇，4mg鹽酸硫胺素，8mg泛酸鈣，8mg尼克酸溶解于50ml水中。將上述兩種溶液混合，加水至100ml。
（17） 吐溫-80溶液：將2g吐溫-80加入100ml 45℃水中，混勻。
（18） 還原型谷胱甘肽溶液：取0.1g還原型谷胱甘肽，加水至100ml.
（19） 甲鹽溶液：稱取5g磷酸氫二鉀和2g磷酸二氫鉀，加水溶解至100ml，液面上加入少許甲苯保存。
（20） 乙鹽溶液：稱取2 g硫酸鎂，0.5 g硫酸亞鐵和0.5 g硫酸錳，加水至100 ml，液面上加少許甲苯保存。
（21） 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：按下表配制，終定容至500ml。

加水至250 ml，攪拌，用10mol/LnaOH溶液調(diào)節(jié)pH 6.8±0.1，然后加入乙鹽溶液2.5 ml，磷酸緩沖液200 ml,用水補至500 ml。4℃冰箱內(nèi)可保存一周 。
（甲、乙鹽混合后易產(chǎn)生沉淀，所以配培養(yǎng)基時不可同時加入，加入甲鹽后先調(diào)節(jié)pH再加入乙鹽。基礎(chǔ)培養(yǎng)基也可直接選購DIFCO公司生產(chǎn)的葉酸測定用培養(yǎng)基）
（22） 瓊脂培養(yǎng)基：

加水至100 ml，置水浴煮至瓊脂熔化，調(diào)節(jié)pH 6.8±0.1。盡快倒入試管中，每管3～5 ml，塞上棉塞，121℃高壓滅菌15 min,取出后直立試管，冷卻至室溫.于冰箱內(nèi)保存。
5.菌種制備與保存
（1） 儲備菌種的制備：將L.C純菌種轉(zhuǎn)接至2個或多個瓊脂培養(yǎng)基管中。37 ℃±0.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h。貯于冰箱內(nèi)，每周轉(zhuǎn)種一次留作儲備菌種。
（2） 種子培養(yǎng)液的制備：取2 ml葉酸標(biāo)準(zhǔn)使用液和10 ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基，混勻，分裝至4支5 ml離心管中，塞上棉塞，121℃高壓滅菌15 min，實驗時現(xiàn)制。
6.操作步驟
所有操作均需避光進行
6.1 樣品制備
（1） 強化劑型樣品：稱取0.1～0.5 g樣品（約含葉酸100～300 ng）于100 ml錐形瓶中，加入50 ml磷酸緩沖液，混勻。121℃高壓水解15 min。定容至100ml，過濾。
（2） 果蔬類：稱取樣品0.2～2 g（約含葉酸100～300 ng），加磷酸緩沖液經(jīng)高壓水解后過濾，殘渣用同樣緩沖液再次高壓，過濾。合并兩次濾液，定容至100ml。
（3） 谷、肉、蛋、魚、豆、奶類等富含淀粉和/或蛋白類樣品：稱取樣品0.1-2 g（約含葉酸100～300 ng），加磷酸緩沖液高壓水解后， 冷卻。加入1 ml雞胰酶和1 ml蛋白酶-淀粉酶液，1 ml甲苯，充分混合，置于37 ℃±0.5 ℃恒溫箱內(nèi)酶解16～20h。酶解后定容至100ml過濾。另取一支試管，加入1 ml雞胰酶，1 ml蛋白酶-淀粉酶和磷酸緩沖液，作酶空白。
（4） 口服液、飲料、果汁等樣品：稱取樣品0.5～2 ml（約含葉酸100～300 ng），加磷酸緩沖液高壓水解后， 冷卻，加入1ml雞胰酶，1 ml甲苯，充分混合，置于37 ℃±0.5 ℃恒溫箱內(nèi)酶解16～20 h。酶解后定容至100ml，過濾。另取一支試管，加入1 ml雞胰酶和磷酸緩沖液，作酶空白。
6.2根據(jù)樣品葉酸含量，將上述濾液用磷酸緩沖液稀釋到一定倍數(shù)，使葉酸終濃度為0.1～0.4 ng/ml。
6.3樣品管的制備：取4支試管，每支試管中分別加入稀釋后樣品液1.0、2.0、3.0、4.0 ml，補充水至體積為5.0 ml，加入5 ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基，混勻。同樣制作酶空白管。
6.4 滅菌：將以上標(biāo)準(zhǔn)系列管、樣品管和酶空白管全部塞上棉塞，121℃高壓滅菌15 min。
6.5 標(biāo)準(zhǔn)系列管的制備：取試管分別加入葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml,相當(dāng)于葉酸含量0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ng，加水補至體積為5.0 ml，再加5 ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基，混勻。如樣品管一樣進行滅菌。標(biāo)準(zhǔn)系列管進行平行測定。
6.6 接種
（1） 接種液的制備：接種前一天，用滅菌的接種針將菌種由儲備菌種管中轉(zhuǎn)種至2支已滅菌的種子培養(yǎng)液中，37℃±0.5℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h。混懸種子培養(yǎng)液，無菌操作下用接種針管將20滴種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至另2支無菌的種子培養(yǎng)液中，37 ℃±0.5 ℃再培養(yǎng)6h。震蕩混勻，制成菌種混懸液。立即使用。（葉酸是L.C生長所必需的，但是如果培養(yǎng)基中葉酸含量過高，細(xì)菌可在體內(nèi)貯存，使測定空白值，影響細(xì)菌生長曲線。將接種液轉(zhuǎn)種再培養(yǎng)6h，有利于消耗細(xì)菌體內(nèi)貯存的葉酸。）
（2） 接種：在無菌操作條件下向每支已滅菌的標(biāo)準(zhǔn)系列管、樣品管和酶空白管接種一滴上述接種液（注意應(yīng)直接滴在培養(yǎng)基內(nèi)），混勻。留一支標(biāo)準(zhǔn)0管不接種，用于測定光密度時調(diào)零。
6.7 培養(yǎng)：置于37 ℃±0.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～40 h。
6.8 測定：用分光光度計，在波長540 nm下，以未接種的標(biāo)準(zhǔn)0管調(diào)節(jié)零點，測定標(biāo)準(zhǔn)管、樣品管和酶空白管的光密度值。
7.計算
（1） 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以標(biāo)準(zhǔn)系列管中葉酸含量為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪制葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。
（2） 結(jié)果計算：根據(jù)樣品管和酶空白管的光密度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的葉酸含量，按下式計算。

式中：
X--樣品中葉酸含量，μg/100g；
c--從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品測定管中葉酸含量，ng；
P--從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得酶空白管中葉酸含量，ng；
V1--樣品制備時定容體積，ml；
F--稀釋倍數(shù)；
V2--制備樣品測定管時加入的樣品液體積，ml；
m--樣品質(zhì)量，g；
100/1000──樣品含量由ng/g換算成μg/100g的系數(shù)。
8.注意事項
（1） 同一實驗室平行測定或重復(fù)測定結(jié)果相對偏差值<10%。
（2） 微生物法的測定結(jié)果為總?cè)~酸含量。
（3） 微生物法測定葉酸常用的菌種除L.C外還有糞鏈球菌（Streptococcus faecalis, S.F. ATCC 8043）。用L.C測定靈敏度高，用S.F.測定重現(xiàn)性好。本方法選用L.C，實驗條件以適宜酪乳酸桿菌的生長條件而定。
（4） 常用的酪蛋白處理方法有酶水解法、酸水解法和堿水解法，由于葉酸在堿性條件下相對穩(wěn)定，所以用堿處理酪蛋白不能破壞葉酸，使培養(yǎng)基中葉酸含量偏高，標(biāo)準(zhǔn)空白值高，線性差。酸水解法和酶水解法均可有效去除葉酸，降解蛋白，使細(xì)菌生長曲線在0～1ng范圍內(nèi)線性良好，其中實驗證明酶水解法更好。
（5） 培養(yǎng)基的pH對細(xì)菌生長很重要，pH6.8～7.2，生長曲線佳。PH過低或過高均不利于細(xì)菌生長。
（6） 本方法配制的培養(yǎng)基和Difico公司的葉酸培養(yǎng)基比較，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性基本一致，對樣品檢測結(jié)果基本一致。
（7） 食物中葉酸多以多谷氨酸鹽形式存在，而L.C只能利用葉酸單、雙、三谷氨酸鹽，所以對天然食品處理時先用軛合酶對葉酸進行降解。常用的軛合酶來源有血漿、雞胰酶和豬腎酶。豬腎酶需從市售豬腎中提取，操作復(fù)雜，提取后對酶的堅定相對困難，且重復(fù)性差，酶的用量難于控制。雞胰酶可從Difco公司購買，可直接使用，重復(fù)性好。雞胰酶的用量與葉酸測定結(jié)果相關(guān)，以往報告中認(rèn)為水解200ng葉酸需加入0.5～1mg雞胰酶。也有人認(rèn)為在pH7.0的環(huán)境下增加酶的用量可提高葉酸水解率。本實驗室認(rèn)為水解200 ng 葉酸，雞胰酶用量宜控制在3～5mg左右，過高可降低水解效果。
（8） 軛合酶在應(yīng)用中也有其局限性。天然食物中往往也含有軛合酶，在食物貯藏、運輸過程中葉酸衍生物之間可發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，使外源性軛合酶作用下降；并且蔬菜水果存在一些酶的干擾物質(zhì)也影響酶的活性，如檸檬酸、鞣酸等。所以測定中樣品需注意保鮮，及時測定；樣品處理方法也應(yīng)視樣品性質(zhì)而定。
（9） 蛋白酶、淀粉酶的應(yīng)用可將包裹于蛋白、淀粉之間或與蛋白結(jié)合的葉酸釋放，有助于樣品檢測。蛋白酶、淀粉酶、雞胰酶聯(lián)合應(yīng)用，水解效力大于3酶效力之和。