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細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)新方法:可實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞動(dòng)態(tài)

更新時(shí)間:2016-04-26   更新時(shí)間:2016-04-26   點(diǎn)擊次數(shù):3737次

細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)新方法:可實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞動(dòng)態(tài)

細(xì)胞趨化性(Chemotaxis,亦被稱為化學(xué)趨向性)是趨向性的一種,指細(xì)胞、細(xì)菌及其他單細(xì)胞、多細(xì)胞生物依據(jù)環(huán)境中某些化學(xué)物質(zhì)而趨向的運(yùn)動(dòng)。趨化性對(duì)細(xì)胞的發(fā)展和其他正常功能一樣*。

在這里,我們以小鼠樹突狀細(xì)胞為例,介紹一個(gè)細(xì)胞的化學(xué)趨化實(shí)驗(yàn)。

 

一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備:

 

  1. 儀器:
  • 細(xì)胞培養(yǎng)箱(高濕度,375%CO2
  • 倒置顯微鏡,具有10X相差物鏡和定時(shí)拍照功能
  • 鏡載加熱孵育系統(tǒng)(375%CO2
  • 可選配置:全自動(dòng)載物臺(tái),自動(dòng)對(duì)焦系統(tǒng)
  • 分析軟件:可選用手動(dòng)分析軟ImageJ“Manual Tracking”模塊,或全自動(dòng)的ibidi提供的WimTaxis進(jìn)行細(xì)胞軌跡追蹤。后使用ibidi公司的“Chemotaxis and Migration Tool” 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

 

  1. 樹突狀細(xì)胞:

實(shí)驗(yàn)前一天準(zhǔn)備工作:

為了減少ibidi細(xì)胞趨化載玻片與培養(yǎng)基中的氣泡,將載玻片和培養(yǎng)基提前24小時(shí)放入培養(yǎng)箱中

8-10天的樹突狀細(xì)胞用200 ng/ml LPS 過(guò)一個(gè)晚上處理(培養(yǎng)基等試劑見(jiàn)表一)

表一:細(xì)胞培養(yǎng)和活化所需的試劑盒培養(yǎng)基

*Lutz, M. B. et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods 223, 77–92 (1999)  

  1. 基質(zhì)膠制備,Collagen Ibovine1.6mg/ml

樹突狀細(xì)胞的化學(xué)趨化實(shí)驗(yàn)所需的試劑如下:

                                         表二:化學(xué)趨化需要的耗材和試劑

 

表三:制備1.6mg/ml 基質(zhì)膠

操作步驟:
●使用表一中的培養(yǎng)基制備  9 x 106 cells/ml 的細(xì)胞懸液
●在1.5ml離心管中小心混勻表三中的1和2號(hào)試劑,避免產(chǎn)生氣泡
●在另一1.5ml離心管中準(zhǔn)備150 μl  collagen 
●使用200μl槍頭從第二步的混合液中吸取30μl(圖一A)
●小心混勻(圖一B),避免產(chǎn)生氣泡
●加入90μl細(xì)胞懸液到上一步混合液中(圖一C)
●小心混勻(圖一D),避免產(chǎn)生氣泡

圖一:制備細(xì)胞-基質(zhì)膠混合液圖示,注意:1)避免產(chǎn)生氣泡,氣泡會(huì)破壞膠原纖維,不能使用Vortex2)膠原混合后,離膠凝大約有5分鐘時(shí)間,如果在凝膠后再進(jìn)行操作會(huì)破壞膠原纖維;3)當(dāng)剛加10x MEMNaHCO3中的時(shí)候會(huì)看到顏色變化,這表明沒(méi)有充分反應(yīng),因此加入混合液到膠原蛋白中后要充分混勻。

 

  1. 細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)

 

  1. 趨化試劑
  • 化學(xué)趨化物:CCL 191.25 μg/ml in RPMI 1640/10%FCS
  • 無(wú)化學(xué)趨化物培養(yǎng)基:RPMI164010%FCS

 

  1. 實(shí)驗(yàn)步驟

 

  • 當(dāng)細(xì)胞-基質(zhì)膠混合液制備好后直接加入ibidi細(xì)胞趨化載玻片的中間通道中(圖二)

?

圖二,在觀測(cè)通道中加入細(xì)胞-基質(zhì)膠混合液

  • 將細(xì)胞趨化載玻片放入培養(yǎng)箱中30-35分鐘,等待膠原蛋白凝固

膠凝固后,分別在兩邊儲(chǔ)液池中加入60μl的化學(xué)趨化物和無(wú)化學(xué)趨化物培養(yǎng)基作為細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)(+/-)(圖三)

 

圖三:加入化學(xué)趨化物(紅色)和無(wú)化學(xué)趨化物培養(yǎng)基(藍(lán)色)

在兩邊儲(chǔ)液池中均加入60μl的無(wú)化學(xué)趨化物培養(yǎng)基作為空白對(duì)照(-/-)(圖四

 

圖四:加入無(wú)化學(xué)趨化物培養(yǎng)基(藍(lán)色)作為空白對(duì)照

 

  • 按說(shuō)明,將通道加液孔塞緊后可以進(jìn)行圖像采集
  • 將載玻片置入鏡載加熱孵育系統(tǒng)中,調(diào)整好采集位點(diǎn),進(jìn)行4小時(shí)的觀測(cè),每2分鐘采集一張圖片

 

圖五:明場(chǎng)1小時(shí)處圖像采集,由于是3D培養(yǎng)環(huán)境,不是所有的細(xì)胞都能被清楚的成像。

 

  1. 圖像處理
  1. 手動(dòng)細(xì)胞軌跡追蹤
  • 下載ImageJ,并安裝Manual Tracking模塊
  • 導(dǎo)入采集的系列圖像到ImageJ中,打開模塊“Manual Tracking”,選擇“Add track”開始記錄細(xì)胞軌跡
  • 選擇一個(gè)細(xì)胞,按照時(shí)間點(diǎn)單擊細(xì)胞,*點(diǎn)擊后,會(huì)有新窗口跳出來(lái)顯示初始位置,以后每次點(diǎn)擊,都將在這個(gè)新窗口中產(chǎn)生一個(gè)該細(xì)胞隨著時(shí)間的新坐標(biāo)
  • 統(tǒng)計(jì)完足夠的細(xì)胞軌跡后,保存軌跡坐標(biāo)表格
  • 至少收集30個(gè)細(xì)胞的軌跡才具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,避免同一細(xì)胞追蹤兩次,去除由于凋亡會(huì)而不能采集完整的軌跡的細(xì)胞
  • 可以將“Overlay dots & lines”.avi格式導(dǎo)出

 

2)全自動(dòng)細(xì)胞軌跡追蹤

使用ibidiWimTaxis自動(dòng)分析平臺(tái),將采集的系列圖像上傳到該平臺(tái),幾個(gè)工作日后,會(huì)得到細(xì)胞軌跡的坐標(biāo)表格數(shù)據(jù)結(jié)果。

 

四、數(shù)據(jù)處理

 

使用遷移指數(shù)( Forward Migration Indices*FMIs)作為比較趨化實(shí)驗(yàn)和對(duì)照試驗(yàn)的參數(shù)。在有趨化物的情況下,空白對(duì)照的FMI和與趨化物垂直方向的化學(xué)趨化的遷移指數(shù)(FMI)應(yīng)是在0點(diǎn)左右。而與趨化物平行方向的化學(xué)趨化的遷移指數(shù)(FMI‖)與0點(diǎn)有顯著的區(qū)別表現(xiàn)出了化學(xué)趨向性。同時(shí),使用Rayleigh Test**對(duì)細(xì)胞趨化的方向性進(jìn)行檢驗(yàn)。如果p值大于0.05表示了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的無(wú)序性,表明沒(méi)有方向性的遷移。此外,遷移速率等參數(shù)也能直接用于分析。

*Foxman et al. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation, J Cell Biol 147, 577-588 (1999)  

**Fisher, N. I. Statistical Analysis of Circular Data, Cambridge University Press, New York (1993) 

 

五、統(tǒng)計(jì)結(jié)果:

實(shí)驗(yàn)優(yōu)勢(shì)總結(jié)

1.可實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞趨化情況;

2.可計(jì)算細(xì)胞的趨化速率;

3.在1組實(shí)驗(yàn)中即可做出連續(xù)性趨化濃度梯度;

4.建立的濃度梯度可維持長(zhǎng)達(dá)48小時(shí),對(duì)快速遷移細(xì)胞或慢速遷移細(xì)胞都適用;

5.可選配套的圖像分析,輕松得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

 

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