細胞內的鈣稱為細胞內鈣，可受到高度調節；這種緊密的調節使細胞內鈣成為了解細胞功能和信號動力學的較佳的工具，使其能夠在細胞遷移、交流和對刺激物或異物作出反應的能力。

　　鈣：細胞過程的多功能指示劑

　　鈣信號可作為讀數來了解病毒在感染過程中利用宿主信號反應的能力，并剖析所涉及的信號通路。有幾種細胞內鈣的熒光指示劑是可用于研究細胞功能；能夠檢查傷口愈合、傳染病、藥物治療等過程中的細胞反應。為此可利用含有熒光鈣指示劑的細胞的活細胞成像，其中熒光的增加表明細胞內鈣的增加。

　　鈣指示劑的種類及其應用

　　鈣指示劑主要分為兩大類：化學指示劑和基因編碼的鈣指示劑。可用于活細胞成像實驗的鈣指示劑類型取決于預期的細胞系、成像長度以及定性或定量數據的預期結果等因素。

　　1.預期細胞系：

　　對于原代細胞系直接的方法是使用熒光染料，將熒光鈣指示劑簡單地添加到培養的細胞中，并在孵育期后成像。

　　與基因編碼的鈣指示劑相比，熒光染料通常更亮、更穩定。在活細胞成像中，熒光染料可以有效地進行短期活細胞成像，但隨著時間的推移細胞有排出染料的趨勢。鈣染料的一個重要考慮因素是使用抑制劑還是激動劑。抑制劑和激動劑也可能影響鈣染料反映，類似于在天然組織中的表達。

　　在廣泛的鈣信號傳導實驗中，已建立的細胞系是可以被轉導以表達遺傳編碼的鈣指示劑，如GCaMP、黃色cameleon等。對現有的不同基因編碼鈣指示劑進行改進，使指示劑更亮，光穩定性更好，動態范圍更大，從而提高了鈣的敏感性。慢病毒轉導是細胞系中使用的一種較佳的工具，它將允許您選擇的指示劑在細胞系中穩定表達。基因編碼報告系統的一個潛在問題是，并非所有細胞系都容易被轉導。　　

　　在用ADP 進行激動劑治療期間，人腸道類器官單層的實時、短期成像。這些有機體單層以綠色表達鈣指示劑 GCaMP6s。ADP 是一種已知的激動劑，用于在細胞中引發細胞內鈣信號傳導。激動劑治療是測試治療劑量反應的較的好方法。

　　2.成像長度

　　對于活細胞成像，時間長度和間隔是需要記住的重要參數。細胞成像過程中的主要關注的是光漂白和光毒性。應避免持續使用激發光，重要的是選擇足夠強的曝光時間和光功率，以檢測鈣信號，但不要過強，以免對細胞造成損害。成像的長度將取決于實驗。對于測試激動劑或細胞反應，這通常是5-20分鐘的較短成像運行，每1-2秒捕獲一次圖像。對于研究傷口修復或病毒感染期間鈣信號傳導的實驗，我們會在18-20小時內成像，每分鐘捕捉一次圖像。　　

　　活細胞成像的技巧

　　考慮要使用的細胞系是很重要的。為了研究鈣動力學，使用形成單層的細胞系將確保感興趣的區域保持聚焦，以捕捉信號動力學，從而獲得較佳質量的視頻和清晰的量化。對于涉及細胞間通訊和鈣動力學的實驗，細胞系融合也是一個重要的考慮因素。為了獲得質量的圖像，選擇合適的載玻片非常重要。有些細胞培養物更喜歡玻璃載玻片而不是光學級塑料載玻片，因此最好測試腔室載玻片。我們的細胞系使用ibiTreat μ-Slide 8 Well high八孔高壁腔室載玻片。　　

μ-Slide 8 Well high（貨號： 80806）

　　活細胞成像是使細胞的密度允許形成一個融合的單層，但不會導致細胞過度擁擠和團塊。在成像過程中需要使用合適的培養基。許多傳統的細胞培養基含有酚紅，它可引起高背景熒光。這使得在成像過程中很難從背景噪聲中分離出真實信號。因此，重要的是用PBS洗滌細胞，并用無酚紅培養基或市售的用于活細胞成像的培養基代替培養基。